干货分享 （送样篇）| 单细胞转录组送样全攻略

 样本类型

 送样量

 样本准备方法

直接寄送新鲜组织样本，由客户进行目标组织取样，宏序生物进行组织的解离，具体方法可参考以下：

处理组织：

1）新鲜组织取样后，后续所有操作均需在4℃低温进行（在冰上操作）。将新鲜的组织放在培养皿中，去除非研究组织，坏死组织，脂肪层，血凝块等。取0.4~1g的新鲜目标组织部位到新的培养皿中，加入DPBS对新鲜的目标组织块进行几次清洗，去除血渍，小心移净液体。

2）使用已灭菌的剪刀和镊子将目标组织部位剪成2~4mm³大小的组织块；将清洗后的组织块转移到完全浸润于4℃预冷1.5ml样品管的组织保存液中，组织加入后需将保存管用组织保存液完全补满，保存管内不留空隙。

3）2~8℃避光运输，取样后30小时内到达实验室，进行组织解离，送来的组织均默认为目标组织。

组织样本采集具体注意事项：

1）需要剔除非目标组织：如去除非研究组织，坏死组织，脂肪层，血凝块等。

2）防止样本干燥：组织样本必须一直保持浸润，不能长时间与空气接触。干燥会导致组织脱水，细胞凋亡；加入组织保存液后需要用组织保存液将组织保存管完全补满，将组织完全浸没与组织保存液中。

3）避免热损伤：尽可能避免对样本造成局部热损伤，由于灼烧而造成的损伤通常是不可挽回的，因此避免使用电刀取样。如不可避免的使用激光刀、电刀等样本采集工具，应剔除热损伤部分，以免对后续试验造成影响。

4）避免化学损伤：应避免消毒试剂或化学物质污染新鲜组织样本，例如止血剂、消毒剂等。

5）血液清洗：哺乳动物成熟红细胞大多无核，无细胞器，在单细胞转录组测序中无研究意义，细胞残留严重影响其它细胞的捕获效率，产生大量无效数据。因此需要在样本采集时使用DPBS或生理盐水对组织样本反复清洗，尽可能清洗干净血液。

6）由于不同组织相同体积的重量差异较大，建议每管组织保存液只放一份黄豆大小（100mg左右）组织。当样本量较多时，可将样本分成几份放置于多管组织保存液中。

7）穿刺样本：必须使用粗针，不可使用真空针采样，如果条件允许，可以采集5条。由于穿刺样本的成功率低，通过增加穿刺样本数可以提高成功率，但是不能保证增加穿刺样本数就一定能成功。

8）标记样本：用marker笔在组织保存管上标记样本编号，标记要清晰、准确、完整、可识别。

9）保存与运输温度：组织样本需严格遵照2~8℃的保存与运输温度，组织冻结或高温（＞8℃）都会给细胞带来损伤，引起细胞凋亡。

对于无法处理全血的客户，具体方法可参考以下：

1）抽取新鲜的外周血5ml至EDTA抗凝管(紫色帽子)中。

2）取样完成后需要立即轻柔上下颠倒采血管4~6次。注意不要产生凝血块。

3）所有操作均需在无菌条件下进行，样本需4h内送达，4℃运输。或者将全血抗凝管使用缓冲介质包裹后，外部使用冰袋包装后寄送，注意从-20℃取出的冰袋不要直接接触样品，以免造成血液样本结冰，导致样品局部冻伤而使细胞失活。

血液样本采集具体注意事项：

1）只能用EDTA抗凝管，不能使用其他类型的抗凝管。

2）取样前需要确认EDTA抗凝管在保质期范围内。

3）标记样本：用marker笔在组织保存管上标记样本编号，标记要清晰、准确、完整、可识别。

对于有条件处理全血，收集PBMC的客户，具体制备方法可参考以下：

1）抽取新鲜的外周血5ml至EDTA抗凝管(紫色帽子)中，注意所有的操作均需在无菌条件下进行，准备的新鲜全血样本需不少于5ml并采用EDTA抗凝。

2）向全血样本中加入等量DPBS稀释全血。

3）在离心管中加入适量分离液（当稀释后血液体积小于3ml时，加入3ml分离液；大于等于3ml，加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。）

4）室温，水平转子500~1000g ，离心20~30min（血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g，注意离心机降速设置中一定要设置成no break，使离心升速与降速平缓）。

5）离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为单个核细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。

6）小心的吸取白膜层细胞到15ml洁净的离心管中，10ml DPBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞。300g，4℃离心10min。

7）弃上清，5ml的DPBS或细胞清洗液重悬细胞，300g，4℃离心10min。

8）重复步骤7），弃上清，进行红细胞裂解处理后，300g，4℃离心10min。弃上清，DPBS重悬细胞。细胞计数仪计数，以按照2×10⁶~1×10⁷/ml/管细胞浓度, 进行冻存，（冻存液配制：90%FBS+10%DMSO）放入冻存管中。

9）保存与运输温度：将样品管用封口膜封口，再放置于50ml离心管中或封口袋中，里面添加棉花等固定（切勿在50ml管内或其他支撑物内加入液氮等危险品），使用厚度4cm以上的泡沫箱包装，10kg以上的干冰运输。注意样品运送前保存在-80°C冰箱；样品保存期间切忌反复冻融。

PBMC样本采集具体注意事项：

1）抽取全血后务必使用EDTA抗凝采血管采集5ml以上新鲜血液。

2）必须全程干冰运输。

3）标记样本：用marker在细胞冻存管上标记样本编号，标记要清晰、准确、完整、可识别。

   如客户已有单细胞悬液制备方法，可按照客户已有方法处理样本，最终选择不含有Ca²⁺、Mg²⁺以及EDTA的缓冲液重悬细胞，细胞总量不少于1x10⁵。

客户需提供细胞悬液样本质控、细胞浓度及活性等指标：

1）细胞大小：直径介于7~40µm（若细胞直径过小建议客户自行选择能够准确检测悬液浓度和活率的仪器）。推荐使用细胞计数仪进行计数。

注：对于非人、鼠物种请提前沟通客户样品的细胞大小，若细胞直径过小（<7µm）请确定客户是否有能准确计数及检测活率的方法及仪器。进行组织解离制备单细胞悬液的客户，有流式分选条件的建议用流式细胞仪去除死细胞。

2）细胞活率：≥80%（细胞计数仪计数）。

3）细胞数目≥10万。

4）细胞大小均一，细胞团及碎片<5%。

5）样品状态：细胞悬液中无红细胞，无细胞粘连，无明显的细胞碎片和细胞团，并保证细胞的完整性。

6）细胞悬液需要在30分钟内进行建库操作，4℃运输，超过20分钟建库需要重新平行测定细胞活率。

7）细胞悬液中不能存在反转录抑制剂，即不含有Ca²⁺和Mg²⁺。

8）将装有单细胞悬液的离心管放置于装满碎冰（不能用干冰！）的泡沫盒中并且在2小时内送达实验室。

风险提示：

   运输过程可能会对单细胞悬液细胞活性及状态产生影响，如果送达实验室后镜检发现细胞活性大幅度降低，客户可与实验室沟通是否使用去死细胞试剂盒进行死细胞去除，但该操作要求初始细胞数量不得少于10万，且可能会损失部分目的细胞群，请客户谨慎选择。

对于贴壁细胞系，具体方法可参考以下：

1）细胞系寄送要求：以贴壁细胞为例，一般选择生长良好的细胞系，培养细胞必须通过镜检观察，判断细胞状态良好且生长密度在80%~90%之间，细胞总量不少于1x10⁵。

2）细胞系直接运输：去掉旧培养液，灌满新的培养液，在细胞培养瓶中装满细胞培养液（不留空气），使用不透气的盖子，将培养瓶盖用封口膜封紧，放些缓冲介质避免培养瓶大幅度晃动，常温运输即可。 

组织制备细胞悬液后冻存，具体制备方法可参考以下：

1）手术后将切下的组织浸于1XPBS管中移至超净台。

2）用1XPBS将新鲜组织清洗干净，在培养皿中用无菌手术剪将新鲜组织在剪碎成约 0.5mm³的组织匀浆。

3）所有操作均需在4℃低温进行（在制冰机制备的碎冰上操作）。

4）对于不同组织类型要根据文献使用不同的酶和消化方法。

5）消化完成后，在超净台内将细胞悬液用40μm细胞筛过滤，收集滤过液，4℃，500g离心5min去上清，保留管底沉淀；加入(1XPBS+0.04%BSA)重悬细胞，细胞大小：直径介于7~40µm（若细胞直径过小建议客户自行选择能够准确检测悬液浓度和活率的仪器，若有红细胞，还需进行裂红处理）。

客户需提供细胞悬液样本质控、细胞浓度及活性等指标：

1）细胞大小：直径介于7~40µm（若细胞直径过小建议客户自行选择能够准确检测悬液浓度和活率的仪器）推荐使用细胞计数仪进行计数。

注：对于非人、鼠物种请提前沟通客户样品的细胞大小，若细胞直径过小（<7µm）请确定客户是否有能准确计数及检测活率的方法及仪器。进行组织解离制备单细胞悬液的客户，有流式分选条件的建议用流式细胞仪去除死细胞。

2）细胞活率：≥80%（细胞计数仪计数）。

3）细胞大小均一，细胞团及碎片<5%。

4）样品状态：细胞悬液中无红细胞，无细胞粘连，无明显的细胞碎片和细胞团，并保证细胞的完整性。

5）细胞数目≥10万进行冻存（冻存液配制：90%FBS+10%DMSO）放入冻存管中。

运输方式：注意样品运送前保存在-80℃冰箱，取出后立即置于干冰箱中。使用厚度4cm以上的泡沫箱包装，10kg以上的干冰运输。样品保存期间切忌反复冻融。