干货分享 （送样篇）| 转录组测序送样：科研人员必备的样本处理手册

我们接受多种类型的转录组样品，包括但不限于组织样品，环境样品，菌体，细胞，血液，RNA，文库。

1）烧杯倒入50mL DEPC水（或PBS、生理盐水等），解剖活体、选取特定组织，切成0.5cm方形（黄豆粒大小），快速清洗表面血污，滤纸吸干残余水分（此步动作要迅速，避免样本中的内源酶降解RNA）；

2）放入提前预冷的RNase-free带螺纹旋盖冻存管中，拧紧盖子（或1.5mL离心管，用锡箔纸包好），放入液氮中速冻0.5h，取出后放入自封袋，转移至-80℃冰箱保存；干冰运输。

备注：

①在没有液氮速冻的条件下，新鲜组织可考虑选择RNAlater等组织保存液：将组织切成0.3cm方形小块，浸没于5倍体积的RNAlater溶液中，4℃浸泡过夜。

②不建议送整块组织，优先小份分装，留好备份。

③次生代谢产物含量极高的动物组织，建议加大送样量。

1）优先选取幼嫩、长势良好、具有群体代表性的植株（植物组织越幼嫩新鲜所含的次生代谢产物就越少），使用DEPC水或75%乙醇快速清洗以去除表面泥污等，滤纸吸干残余水分，然后切成0.5cm方形小块（黄豆粒大小）；

2）放入提前预冷的RNase-free带螺纹旋盖的冻存管中，拧紧盖子（或用1.5mL离心管，用锡箔纸包好），放入液氮中速冻0.5h，取出后放入自封袋，转移至-80℃冰箱保存，干冰运输。

备注：

①不建议送整块组织，优先小份分装，留好备份。

②请不要使用TRIzol ，RNAlater等直接浸泡植物组织。

③含水量高、表面蜡质层厚，或者次生代谢物含量极高的组织，需加大送样量。

固体培养基培养

1）在菌体生长最旺盛的对数期取样，打开培养皿盖后，培养皿正面倾斜向下

2）将灭菌后的无RNase长柄刀片在酒精灯火焰上过几遍，冷却后用刀片轻轻刮下菌体，注意不要刮到培养基；

3）放入提前预冷的RNase-free带螺纹旋盖冻存管中，拧紧盖子（或1.5mL离心管，用锡箔纸包好），放入液氮中速冻0.5h，取出后放入自封袋，转移至-80℃冰箱保存；干冰运输。

液体培养基培养

1）用RNase-free枪头吸取1mL对数期（OD600=0.5-0.8）菌悬液移入1.5mL无酶管中，4℃、10000rpm离心2min，弃上清；

2）再加入1mL菌悬液，重复以上操作（即总共取菌液2mL）；

3）放入提前预冷的RNase-free带螺纹旋盖冻存管中，拧紧盖子（或1.5mL离心管，用锡箔纸包好），放入液氮中速冻0.5h，取出后放入自封袋，转移至-80℃冰箱保存；干冰运输。

备注：

①小份分装，留好备份。

②样品直接冻存即可，无需用TRIzol、RNAlater等浸泡保存。

贴壁细胞

1）贴壁细胞培养结束后，观察细胞密度和状态；

2）移液器吸去培养皿中细胞培养基；

3）可用刮棒刮取或胰酶消化，用预冷的PBS缓冲液快速洗2次；

4）低速离心除去PBS缓冲液；

5）加入少量预冷的PBS缓冲液，吸混后转入冻存管，低速离心后弃尽PBS缓冲液；

6）细胞沉淀以每5×106个加1mL TRIzol比例，吹打匀浆，每管1mL分装入提前预冷的RNase-free冻存管中，拧紧盖子（或1.5mL离心管，用锡箔纸包好），液氮速冻0.5h，取出放入自封袋，-80℃保存；干冰运输。

悬浮细胞

1）悬浮细胞培养结束后，观察细胞密度和状态；

2）离心去除培养基；

3）收集的细胞用预冷的PBS缓冲液快速洗2次；

4）低速离心去除PBS缓冲液；

5）加入少量预冷的PBS缓冲液，吸混后转入冻存管，低速离心后弃尽PBS缓冲液；

6）细胞沉淀以每5×106个加1mL TRIzol比例，吹打匀浆，每管1mL分装入提前预冷的RNase-free冻存管中，拧紧盖子（或1.5mL离心管，用锡箔纸包好），液氮速冻0.5h，取出放入自封袋，-80℃保存；干冰运输。

备注：

①尽量避免细胞污染，常量细胞一定要加TRIzol，切勿直接冻存。

②如细胞出现成团，需用吸头把细胞团吹打散。

全血

（一）TRIzol法样本制备

1）全血样本，建议使用（非肝素钠）EDTA抗凝管采取血液样本；

2）加入3倍体积的TRIzol裂解液，吹打匀浆、涡旋混匀，室温孵育5min；

3）然后用RNase-free冻存管按1mL/管分装，立即使用液氮速冻，-80℃保存，干冰运输。

备注：不要整个采血管冻存后送样，解冻会导致RNA降解。

（二）使用QIAGEN公司的PAXgene Blood RNA Tube采血管

每管盛装2.5mL的全血，采集完血后立即温和颠倒10次左右，室温放置2-12小时，随后-80℃冰箱保存，干冰运输。

白细胞

（一）自然沉降法

1）将抗凝管采集的2mL血液垂直室温静置1h、红细胞自然下沉后，血液分为3层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，分界面有一呈灰白色的白细胞层；

2）用200μL枪头或毛细管吸取分界面处白细胞层，移入RNase-free 冻存管；

3）加入适量无 Ca2+、Mg2+ Hank’s液（D-Hank’s液，或D-PBS），混匀，4℃、2000rpm离心10min，弃上清；相同步骤洗涤两次，吸净残液；

4）细胞加1mL TRIzol，吹打匀浆，拧紧盖子（或1.5mL离心管，用锡箔纸包好），立即使用或液氮速冻、-80℃保存、干冰运输。

（二）红细胞裂解法

1） 将抗凝管采集的2mL血液转入无酶EP管，加入3倍体积红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5min，期间再颠倒混匀几次；

2） 放入离心机，4℃、3000rpm离心5min，弃上清；

3） 加入适量无Ca 2+、Mg 2+ Hank’s 液（D-Hank’s液，或D-PBS），混匀，4℃、2000rpm离心10min，弃上清；相同步骤洗涤两次，吸净残液；

4） 细胞加1mL TRIzol，吹打匀浆，然后移入RNase-free 冻存管、拧紧盖子（或1.5mL 离心管，用锡箔纸包好），立即使用或液氮速冻、-80℃保存、干冰运输。

PBMC

密度梯度离心（Ficoll法）

1）取一支15mL无酶离心管，加入5mL Ficoll-Paque 淋巴细胞分离液；

2）再准备一支15mL无酶离心管，加入5mL抗凝管采集的全血，并按1:1体积加入5mL1×PBS溶液进行稀释，轻柔混匀；然后将稀释的血液用移液枪沿管壁缓缓加到第I步已准备好的Ficoll-Paque淋巴细胞分离液管中，保证分层清晰；

3）1500rpm室温离心30min，离心结束后取出，管中液体将分成4层，其中第二层PBMC较少，可能呈一层白膜状。移液器洗除上层部分液体，剩余1ml左右，然后吸取白膜层细胞转移到新的15ml无酶离心管；

5）加入适量无Ca2+、Mg 2+ Hank’s 液（D-Hank’s液，或D-PBS），混匀，4℃、2000rpm离心10min，弃上清；相同步骤洗涤两次，吸净残液；

6）细胞加1mL TRIzol，吹打匀浆，然后移入RNase-free冻存管、拧紧盖子（或1.5mL离心管，用锡箔纸包好），立即使用或液氮速冻、-80℃保存、干冰运输。

1）石蜡切片或蜡卷厚度5-10µm，组织区域面积≥10mm×10mm，需5-10片；

2）若为穿刺样本，由于表面积小,建议10片以上；

3）若为石蜡块，厚度需达到40µm；

4）石蜡切片置于切片盒中，蜡卷可放1.5ml离心管中保存；常温运输即可；

5）FFPE样本不宜保存时间过长，建议使用1年内的FFPE样本。